Um grupo de pesquisadores da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP) da USP obteve uma nova estratégia para combater a leishmaniose cutânea, doença negligenciada que ainda depende de tratamentos antigos, tóxicos e de eficácia variável. O trabalho, publicado no Journal of Medicinal Chemistry, identifica os primeiros inibidores covalentes (que formam ligação química de longa duração) de uma enzima essencial à sobrevivência do parasita Leishmania braziliensis, um dos principais causadores da doença no Brasil e em outros países das Américas.
Primeira autora do artigo, a pesquisadora Thamires Quadros Froes teve participação central na descoberta, resultado de seu estágio de pós-doutorado realizado junto ao Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Fragmentos Moleculares (Craft) da FCFRP, sob coordenação da professora Maria Cristina Nonato e do professor Flávio da Silva Emery.
Conta a professora Maria Cristina que o Craft vem estudando a enzima do parasita, a diidroorotato desidrogenase (DHODH), e que o objetivo da equipe agora foi investigar uma nova forma de bloquear essa enzima, que é responsável por uma etapa fundamental da produção de pirimidinas — componentes indispensáveis para a formação do DNA e do RNA. “Como o parasita precisa produzir DNA e RNA para crescer, se dividir e manter suas funções celulares, a atividade dessa enzima é muito importante para sua sobrevivência e multiplicação. Quando bloqueamos a DHODH, interferimos nessa rota metabólica fundamental”, explica a professora.
Para a inibição dessa enzima essencial à vida do parasita, os pesquisadores desenvolveram derivados do ácido barbitúrico (composto orgânico) capazes de se ligar de maneira covalente, alcançando a estabilidade na enzima parasita. Compostos estes, porém, alerta a professora, que ainda não equivalem a medicamentos; representam um ponto de partida para o desenvolvimento de novas moléculas que, no futuro, poderão ser utilizadas para tratamentos mais eficazes, seletivos e seguros contra a leishmaniose.
Problema ainda sem solução ideal
A leishmaniose cutânea é uma doença que causa feridas e úlceras na pele; não contagiosa, é transmitida pela picada do mosquito-palha infectado, afetando principalmente populações de regiões tropicais e seguindo, até hoje, como uma das chamadas doenças negligenciadas — aquelas que, por atingir majoritariamente países de baixa e média renda, recebem historicamente menos investimento em pesquisa e desenvolvimento de novos medicamentos.
Segundo a pesquisadora, apesar das limitações, os tratamentos utilizados atualmente no controle da doença continuam a funcionar. Mas trata-se de fármacos que apresentam toxicidade, exigem administração por períodos prolongados ou por via injetável e produzem respostas que variam de acordo com a espécie do parasita, a região geográfica e as características do paciente.
Assim, explica a escolha do L. braziliensis para o estudo não apenas pela relevância médica, mas por se tratar de uma espécie que pode causar desde lesões cutâneas até formas mais graves, com comprometimento de mucosas. Já o alvo terapêutico, a professora adianta que o Craft acumula décadas de conhecimento bioquímico e estrutural sobre a DHODH dessa espécie, o que permitiu usar a estrutura tridimensional da enzima para guiar o desenho racional de novas moléculas.
Uma ligação química que não se desfaz
Como resultado principal, o estudo conseguiu desenvolver os primeiros inibidores covalentes para a DHODH de Leishmania braziliensis. Segundo os pesquisadores, na inibição covalente, o composto não apenas não se encaixa temporariamente na enzima, mas forma uma ligação química com um aminoácido específico da proteína.
Dentre os compostos sintetizados e testados, um se destacou: a molécula batizada de 2i. Nos ensaios de laboratório, ela inibiu fortemente a atividade da DHODH do parasita, apresentou atividade contra formas do parasita cultivadas em placa e, ponto considerado crucial pelos pesquisadores, não inibiu a versão humana da mesma enzima nem se mostrou tóxica para células de defesa humanas usadas nos testes.
Além de eficaz e segura, a estratégia utilizada, adiantam, pode proporcionar uma inibição mais forte e duradoura. Para tal, exige que o composto reconheça primeiro a enzima correta e reaja com o aminoácido desejado; caso contrário, poderia se ligar aleatoriamente a outras proteínas.Neste estudo, os compostos foram planejados para reagir como uma cisteína (aminoácido essencial) localizada no sítio ativo da DHODH da Leishmania braziliensis, a Cys131. No caso dos derivados do ácido barbitúrico, conseguiram demonstrar que são capazes de inibir a atividade da enzima e que, para essa inibição, importa a presença de uma porção química capaz de reagir com a Cys131.
Essas informações também foram confirmadas, utilizando estruturas tridimensionais da enzima, produzidas com informações de cristalografia de raios X (técnica que identifica a organização interna de átomos e moléculas). Segundo a professora Maria Cristina, “as estruturas permitiram visualizar, em escala atômica, como as moléculas ocupam o sítio ativo, e confirmar a formação da ligação covalente com a cisteína”.
Os pesquisadores adiantam que a compreensão de como as moléculas se ligam à enzima fornece uma base estrutural para que os compostos possam ser modificados e aprimorados, um ponto de partida para a continuidade do desenvolvimento dos candidatos a inibidores da enzima.
Seletividade como chave para a segurança
Um dos maiores desafios no desenho de inibidores covalentes é garantir que eles ajam apenas sobre o alvo desejado. Como a DHODH humana e a do parasita pertencem a classes diferentes de enzimas, com estruturas e mecanismos distintos — incluindo a presença e a posição da própria Cys131, ausente na enzima humana nesse formato —, foi justamente essa diferença que o grupo explorou para desenhar moléculas com maior afinidade pela enzima da Leishmania.
Com as estruturas tridimensionais das duas proteínas (humana e do parasita), puderam planejar moléculas que interagem com a DHODH da Leishmania, mas não com a enzima humana. “Durante a otimização, os compostos precisam ser testados paralelamente contra as duas enzimas. Além disso, é necessário avaliar sua possível interação com outras proteínas humanas. O objetivo é aumentar progressivamente a atividade contra o parasita e, ao mesmo tempo, reduzir a possibilidade de efeitos sobre células humanas”, diz a professora.
Potencial para tratar diferentes formas de Leishmania
Apesar dos resultados promissores, os compostos continuam em avaliação. Desde a conclusão do estudo, conta a professora Maria Cristina, a pesquisa já avançou na busca por novos derivados com maior potência e melhores propriedades farmacocinéticas — relacionadas à absorção, distribuição, estabilidade e permanência dos compostos no organismo. Resultados que ainda estão sendo finalizados para nova publicação científica.
Segundo a professora, as próximas etapas incluem ampliar os testes de toxicidade em células humanas, avaliar a atividade dos compostos contra diferentes espécies de Leishmania e confirmar sua capacidade de penetrar em células infectadas para deter a multiplicação do parasita nas condições reais da infecção. Os candidatos a compostos mais promissores deverão então avançar para estudos em modelos animais, nos quais serão avaliadas eficácia, segurança, dose e via de administração, antes de qualquer perspectiva de testes clínicos em humanos.
A estratégia também não se limita à L. braziliensis. Como o sítio de ligação explorado pelos compostos é conservado entre diferentes espécies do parasita, o grupo já expande os estudos para avaliar a inibição de DHODHs de outras espécies de Leishmania e sua atividade direta contra esses parasitas — ainda que possam existir diferenças entre espécies quanto à entrada da molécula na célula, ao metabolismo e à sensibilidade do parasita.
Ciência básica, colaborativa e feita no Brasil
Para a professora Maria Cristina, três pontos merecem destaque na atual conquista do grupo. O primeiro é o caráter do trabalho como ciência básica e descoberta inicial de fármacos, cujo principal avanço foi demonstrar uma nova possibilidade de inibição da DHODH e revelar, em nível atômico, como ela ocorre.
O segundo é a natureza colaborativa e multidisciplinar da pesquisa, conduzida no âmbito do Craft, que reúne pesquisadores de diferentes áreas — do planejamento e síntese das moléculas à caracterização bioquímica, estrutural e biológica. “Nenhuma dessas etapas, isoladamente, seria suficiente para produzir os resultados alcançados”, observa. Além da equipe do Craft, o estudo contou com a participação de pesquisadores da Universidade Federal de São Paulo (Unifesp) e da organização internacional Drugs for Neglected Diseases initiative (DNDi).
Por fim, Nonato ressalta o significado mais amplo do estudo: “A pesquisa mostra a importância de desenvolver no Brasil conhecimento e tecnologias voltados para doenças negligenciadas que afetam principalmente populações de regiões tropicais e que, historicamente, recebem menos investimentos em pesquisa e desenvolvimento de novos medicamentos”.
O artigo Barbituric Acid Derivatives as Covalent Inhibitors of Leishmania braziliensis Dihydroorotate Dehydrogenase, publicado no Journal of Medicinal Chemistry, pode ser lido aqui: https://pubs.acs.org/jmcmar/article/68/18/18869/5234847/Barbituric-Acid-Derivatives-as-Covalent-Inhibitors
Matéria: Vinícius Pereira | Jornal da USP.
