No enfrentamento à pandemia de covid-19, a chegada das vacinas representou o ponto de inflexão para controlar o contágio. Em paralelo, foram desenvolvidos medicamentos que auxiliam os médicos a lidarem com os casos clínicos. Mas a possibilidade de que emergências semelhantes voltem a assolar o planeta no médio prazo estimula a continuidade da pesquisa. Uma destas iniciativas, que envolve docentes da Unesp e da USP, explora a possibilidade do uso de ondas sonoras para destruir os microrganismos. Os resultados foram publicados na revista científica Scientific Reports.
Vacinas e medicamentos, as técnicas terapêuticas mais utilizadas para o controle de doenças, baseiam sua capacidade de atuação em propriedades químicas e biológicas. Mas, após o advento da covid-19, cresce a investigação de terapias amparadas em propriedades físicas, não químicas. É o caso do uso de ondas sonoras emitidas por máquinas de ultrassom para romper a estrutura de vírus respiratórios e controlar a carga viral. No artigo, os pesquisadores brasileiros relataram os resultados de experimentos in vitro, nos quais as ondas emitidas pelo ultrassom desestabilizaram o vírus da covid-19, o SARS-CoV-2, e o da influenza A, o H1N1, causando a ruptura do envelope viral, a fragmentação das partículas e a redução da capacidade dos vírus de infectar células.
O emprego deste tipo de recurso no tratamento da saúde humana não é algo simples. Muitas das técnicas para a desinfecção in vitro ou ambiental que utilizam princípios físicos operam em condições de alta intensidade, o que as torna pouco compatíveis com aplicações terapêuticas em tecidos vivos. A radiação ultravioleta, por exemplo, possui a capacidade de inativar vírus rapidamente. Porém, o potencial para causar danos aos tecidos é igualmente elevado. Outra alternativa, a radiação não ionizante, também é reconhecida por causar danos às estruturas biológicas.
Em testes iniciais, os pesquisadores observaram que a exposição ao ultrassom mostrou-se efetiva, sem que fossem registradas alterações significativas na temperatura ou no pH. Tais resultados abrem a possibilidade de explorar uma estratégia física de inativação viral que, em vez de atuar por meio de agentes químicos ou de altas doses de radiação, busca aproveitar as próprias características mecânicas das partículas virais, como seu formato.
A equipe reúne profissionais de diferentes áreas, incluindo física, virologia e caracterização de materiais. Dentre eles estão o professor Odemir M. Bruno, do Instituto de Física da USP, em São Carlos; o professor Carlos José Leopoldo Constantino e a pós-doutoranda Gilia Cristine Marques Ruiz, ambos da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Unesp, câmpus de Presidente Prudente.
A investigação começou durante a pandemia de covid-19, quando o grupo de Bruno trabalhava no desenvolvimento de sensores para detectar o vírus. Nesse período, os pesquisadores encontraram um modelo teórico que sugeria a possibilidade de partículas virais entrarem em ressonância com determinadas ondas acústicas. A hipótese abriu uma nova frente de pesquisa, que passou a ser desenvolvida a partir de 2021.
Uma questão de ressonância
O princípio físico utilizado na pesquisa é a ressonância. Basicamente, quando uma onda sonora encontra um objeto capaz de vibrar em uma frequência compatível, a energia transferida para ele pode ser acumulada e ampliar a sua oscilação, o que pode levar, por exemplo, ao seu colapso. “É o mesmo processo de alguém que toca violino e consegue quebrar uma taça de cristal”, explica Bruno. “O que é interessante é que o violino não é uma fonte agressiva; ele é suave e harmônico. Mesmo assim, consegue reagir com o cálice de cristal e quebrá-lo. Aplicamos esta mesma estratégia usando o ultrassom contra os vírus”, completa.
Um detalhe essencial para um resultado positivo é o formato do vírus. Por ser esférico, a vibração se distribui igualmente por toda a sua estrutura, o que beneficia o efeito de ressonância. Assim, quando a frequência do ultrassom se aproxima de uma das frequências naturais de vibração da partícula, a onda consegue transferir energia para o vírus de maneira mais eficiente. É como empurrar um balanço sempre no mesmo ritmo: pequenos impulsos sucessivos podem fazer o movimento aumentar. No caso do vírus, esse aumento corresponde a deformações repetidas do seu envelope. Se a vibração atingir intensidade suficiente, as tensões mecânicas produzidas podem superar a resistência da estrutura viral, provocando deformações, rupturas e até a fragmentação da partícula.
“Isso faz com que ocorra um fenômeno que muda a configuração do vírus, tornando-o inativo. Ele passa por uma mudança completa em sua morfologia e, conforme os nossos experimentos, perde a capacidade de infectar e se reproduzir”, afirma Bruno. A equipe trabalhou com ultrassom de alta frequência, na faixa de 3 a 20 megahertz (MHz), utilizando equipamentos de diagnóstico por imagem. Em uma das condições analisadas, uma frequência de 7,5 MHz foi aplicada durante cinco minutos para avaliar alterações na estrutura das partículas virais.
Para verificar se os efeitos observados poderiam ser explicados por aquecimento ou alterações químicas no meio, os pesquisadores acompanharam também a temperatura e o pH das amostras. Sob as condições de ressonância, os dois parâmetros permaneceram estáveis. Esse resultado é importante porque diferencia o mecanismo estudado de outro efeito conhecido do ultrassom: a cavitação. Em frequências mais baixas, na ordem de quilohertz, as ondas podem favorecer a formação e o colapso de bolhas no líquido. O processo produz calor e ondas de choque, podendo provocar danos de maneira pouco seletiva. Por isso, a cavitação é útil em processos de assepsia e esterilização, mas não pode ser utilizada em aplicações terapêuticas.
No trabalho, os pesquisadores observaram que as condições de alta frequência não apresentavam os sinais esperados de cavitação. “Você tem um ultrassom tão inofensivo quanto o ultrassom de exame pré-natal que já é usado há décadas, e é essa onda acústica que vai ser capaz de inativar o vírus”, compara Bruno. O pesquisador ressalta, porém, que a aplicação terapêutica ainda está em investigação e que o fenômeno precisa ser melhor compreendido antes de chegar a testes em organismos.
O que acontece com o vírus
Para saber o que acontecia com os vírus depois da exposição às ondas acústicas, a equipe utilizou diferentes técnicas de caracterização. A microscopia eletrônica de varredura e a microscopia de força atômica mostraram alterações na superfície do SARS-CoV-2. Partículas que antes apresentavam formato aproximadamente esférico passaram a exibir contornos irregulares, redução de diâmetro, deformações e rupturas do envelope viral.
Também foram observadas alterações no diâmetro médio das partículas virais. No SARS-CoV-2, por exemplo, as amostras não tratadas apresentavam um tamanho em torno de 107 nanômetros. Após a exposição ao ultrassom, surgiram componentes menores, resultantes da desestruturação das partículas. No H1N1, o efeito foi ainda mais intenso: depois do tratamento, não foi detectado sinal das partículas na faixa de tamanho analisada. Foi nesse ponto que entrou a contribuição do grupo da Unesp em Presidente Prudente. O desafio era caracterizar partículas que são pequenas demais para serem observadas adequadamente por técnicas microscópicas convencionais utilizadas na biologia e na química.
“Os pesquisadores da USP de São Carlos nos procuraram com o desafio de caracterizar o vírus. Devido ao fato de que suas dimensões estão em escala nanométrica, numa faixa de tamanho entre 100 e 120 nanômetros, não é possível observar os detalhes de sua estrutura usando a principal técnica de caracterização na biologia, que é a microscopia óptica convencional”, explica Gilia. A equipe utilizou, então, a técnica de espalhamento dinâmico de luz, conhecida pela sigla DLS, do inglês Dynamic Light Scattering. O método permite estimar o tamanho médio de partículas dispersas em um líquido a partir da análise das flutuações da luz espalhada por elas.
Ou seja, o equipamento ilumina a amostra com um feixe de laser e observa como a luz se espalha ao encontrar as partículas. Como estão em movimento constante no líquido, a intensidade da luz detectada também varia ao longo do tempo. Essas variações permitem calcular o tamanho aproximado das partículas presentes na amostra: partículas maiores e menores produzem padrões diferentes de movimento e, consequentemente, de espalhamento da luz. “Com o DLS, conseguimos medir os tamanhos das amostras de vírus antes e após a exposição ao ultrassom. Isso permite que a gente verifique se algo mudou e quais foram as mudanças”, explica Gilia.
A técnica já era utilizada pelo grupo de Presidente Prudente para estudar sistemas artificiais de membranas celulares, sintetizadas em laboratório. O desafio foi adaptar o método para trabalhar com amostras virais reais. Além do tamanho reduzido, essas partículas apresentam uma composição complexa, formada por envelope, proteínas e material genético. “A gente teve que otimizar o equipamento. Alteramos os algoritmos, mexemos no tempo de exposição do feixe de laser e trabalhamos no preparo da amostra de vírus”, relata Gilia. Também foi necessário considerar fatores como o solvente utilizado e o processo de descongelamento das amostras.
Os resultados do DLS ajudaram a confirmar que as partículas virais expostas ao ultrassom apresentavam dimensões compatíveis com as esperadas para os vírus estudados e que a exposição modificou esse perfil. “Foi com o DLS que conseguimos confirmar que, após a exposição ao ultrassom, o vírus SARS-CoV-2 foi fragmentado em tamanhos menores e o H1N1 nem mesmo foi detectado”, conta a química.
Menos vírus capazes de infectar
Além da destruição física das partículas, os pesquisadores queriam saber se a mudança estrutural tinha efeitos biológicos. Para isso, amostras de SARS-CoV-2 tratadas e não tratadas foram utilizadas para infectar células Vero E6. Depois de 24 horas, os pesquisadores analisaram a presença de proteínas virais e de material associado à replicação do vírus.
Os testes mostraram redução da infecção após a exposição ao ultrassom. Entre as condições avaliadas, aquelas próximas de 7,5 MHz apresentaram o efeito mais pronunciado sobre a linhagem de referência do SARS-CoV-2. O estudo também avaliou as variantes Gamma e Delta. Embora o ultrassom tenha reduzido a infectividade nesses casos, elas apresentaram maior resistência e a eficiência variou conforme a frequência e o equipamento utilizado.
A observação introduz uma questão importante: se a frequência capaz de produzir ressonância depende das características físicas do vírus, seria necessário encontrar uma condição específica para cada tipo de partícula? Para Bruno, essa é uma das possibilidades que tornam o fenômeno particularmente interessante. A frequência de ressonância estaria relacionada a características como tamanho, geometria e propriedades mecânicas da partícula, e não diretamente à sequência genética ou à composição molecular do vírus.
“Para nós, a única coisa que importa é a geometria do vírus”, afirma. Segundo o pesquisador, em princípio, vírus esféricos com determinadas propriedades físicas poderiam responder a uma faixa específica de frequências. Isso abre a possibilidade de pensar em uma estratégia menos dependente das mutações que alteram a composição molecular dos vírus.
Ainda assim, os próprios resultados mostram que essa generalização precisa ser investigada. As variantes Gamma e Delta do SARS-CoV-2 não responderam exatamente da mesma maneira aos equipamentos testados. O artigo relaciona essas diferenças a características físicas que podem alterar a estabilidade mecânica das partículas, como rigidez, espessura do envelope e propriedades viscoelásticas. Pequenas diferenças estruturais podem modificar os modos de vibração e, portanto, a frequência em que a ressonância é mais eficiente.
Uma terapia geral
Um dos potenciais benefícios de explorar técnicas físicas em processos terapêuticos está na possibilidade de atuar sobre características estruturais dos patógenos, em vez de depender diretamente de sua composição molecular. Esse último caso é o que ocorre com as vacinas e medicamentos. Para que se mostrem efetivos, é necessário investigar a biologia e a química dos patógenos. Porém, quando essas características mudam por conta de uma adaptação do vírus ou da bactéria, são necessárias novas investigações e o desenvolvimento de novos imunizantes e medicamentos.
É por isso que doenças como a influenza e a covid-19 contam com vacinas sazonais, que devem ser atualizadas a cada ano. “Os vírus passam por diferentes mutações e novas cepas surgem, o que, muitas vezes, diminui a eficácia dos tratamentos que já existiam”, conta Bruno. Essa problemática, entretanto, não atinge tratamentos baseados em princípios físicos. No caso do ultrassom, o mais importante é o formato dos vírus: característica que permanece inalterada entre as diferentes cepas e mutações. “Nessa abordagem, não interessa o reconhecimento de uma sequência específica de RNA ou as proteínas envolvidas, interessa, principalmente, o fator forma e tamanho do vírus. Então, com o ultrassom hospitalar, podemos, de certa forma, ter a possibilidade de explorar o mesmo mecanismo em diferentes vírus com características semelhantes”, diz Gilia.
Entretanto, mesmo em estágio inicial, o tratamento já encontrou uma limitação: o ultrassom atua sobre o vírus enquanto ele está na forma de uma partícula completa, antes de entrar na célula. Depois da infecção, sua estrutura se desfaz e o material genético passa a utilizar a maquinaria celular para se replicar. Por isso, a proposta não seria substituir os antivirais, mas eventualmente atuar de forma complementar, reduzindo a quantidade de partículas virais disponíveis para novas infecções. “Esse tipo de técnica, provavelmente, não será utilizada para eliminar o vírus, mas, sim, para reduzir a carga viral. Então, ela funcionaria em conjunto com outras terapias já conhecidas”, afirma Bruno.
Antes de pensar em uma aplicação terapêutica, contudo, os pesquisadores ainda precisam testar o fenômeno em sistemas biológicos mais complexos. “Estamos falando de uma técnica física que pode ser aplicada para um problema de saúde, mas ainda temos muitas perguntas”, pondera Gilia. “Precisamos entender melhor o mecanismo, testar outros vírus e verificar como esse efeito se comporta em condições mais próximas das que encontramos no organismo”, diz. Assim, mais do que apresentar uma solução pronta para o combate às infecções virais, o estudo abre uma nova frente de investigação: utilizar as propriedades físicas dos vírus — sua forma, tamanho e capacidade de vibração — como possíveis pontos de partida para sua inativação.
Matéria: Malena Stariolo | Jornal da Unesp.
